細(xì)胞簡(jiǎn)介：

大鼠陰道上皮分離自陰道組織；陰道位于膀胱、尿道和直腸之間，是一個(gè)富有彈性的管狀器官。它在人類生殖過(guò)程中具有多種生理功能，是連接子宮與外陰的通道，是排出月經(jīng)血、娩出嬰兒的必經(jīng)之路，也是一個(gè)重要的性交器官。陰道壁按組織學(xué)由外到內(nèi)分三層，即黏膜層、肌層和外膜，陰道黏膜是最外層，也就是最淺表的那一層，相當(dāng)于皮膚的最外面層一樣。陰道上皮呈粉紅色，表面為復(fù)層鱗狀上皮，但無(wú)角化層。在正常的月經(jīng)周期中，陰道上皮脫落的上皮細(xì)胞的形態(tài)隨著卵巢內(nèi)分泌的變化而改變，因此通過(guò)陰道脫落上皮的病理檢查便可以初步判斷卵巢的內(nèi)分泌功能狀況。陰道粘膜是指陰道內(nèi)壁分泌的保持陰道內(nèi)壁表面濕潤(rùn)，保持表面活力的粘液膜層，因?yàn)槠浔砻娑嗾吵?，故為粘膜。在卵泡期，陰道粘膜受雌激素作用，上皮增厚，表皮?xì)胞角化；陰道上皮細(xì)胞內(nèi)糖原豐富（注：陰道粘膜上皮是復(fù)層扁平上皮又名“復(fù)層鱗狀上皮”），在陰道桿菌作用下分解為乳酸，保持陰道的酸性環(huán)境；排卵后，受孕激素作用，陰道粘膜上皮大量脫落，角化現(xiàn)象消失。
方法簡(jiǎn)介：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠陰道上皮采用yi蛋白酶-膠原酶混合消化法結(jié)合差速貼壁法，并通過(guò)上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。
質(zhì)量檢測(cè)：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的大鼠陰道上皮經(jīng)Cytokeratin-18免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

1) 將5-10d的乳鼠浸泡入75%乙醇中，移入生物安全柜，

2) 從胸部解剖乳鼠，取出雙肺置于預(yù)冷的PBS中，盡可能的除去結(jié)締組織等，

3) 取肺邊緣部分，剪碎，將組織塊移入T25培養(yǎng)瓶中，倒置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，

4) 2h后，培養(yǎng)瓶中注入2 mL內(nèi)皮培養(yǎng)基，小心將培養(yǎng)瓶正置于培養(yǎng)箱，確保組織塊不會(huì)飄起來(lái)，

5) 每3d換液2mL，待細(xì)胞從組織塊中爬出來(lái)后，隔2d換液，待細(xì)胞融合達(dá)到60-70%左右時(shí)，去除組織塊，將肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞重新鋪瓶。

1、您收到細(xì)胞后，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作：

取出T-25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置4-6小時(shí)或過(guò)夜，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，然后換用新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)或進(jìn)行傳代。

2、細(xì)胞傳代：

1）細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2）添加0.125%消化液約2ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1500rpm/min，離心5min；

3）棄上清，沉淀細(xì)胞用12ml培養(yǎng)基重懸，然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4）待細(xì)胞貼壁后，觀察培養(yǎng)結(jié)果，之后進(jìn)行換液培養(yǎng)或傳代。

3、細(xì)胞凍存：

1）細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2）添加0.125%消化液約2ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，再加入培養(yǎng)液終止消化，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1500rpm/min，離心5min；

3）用適當(dāng)量的凍存液（基礎(chǔ)培養(yǎng)基：FBS：DMSO=7:2:1）重懸細(xì)胞，并放置于凍存管中；

4）先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃ 1.5h，然后將其移入-80℃過(guò)夜，24h后轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。

4、細(xì)胞復(fù)蘇：

1）從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具）， 快速將其置入37℃水浴中解凍，直至凍存管中無(wú)結(jié)晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；

2）將凍存管中的細(xì)胞移至15ml無(wú)菌離心管中，滴加入培養(yǎng)液5ml混勻細(xì)胞，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至適當(dāng)面積大小的培養(yǎng)皿中；

3）放置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4）第二天，換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。