【儀表網(wǎng) 研發(fā)快訊】3月18日，Cell Stem Cell以封面文章的形式在線發(fā)表了中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心(神經(jīng)科學(xué)研究所)、神經(jīng)科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室陳躍軍研究組與其他科研機(jī)構(gòu)合作完成的題為《人神經(jīng)分化過程中跨時(shí)間段的克隆譜系追蹤》的研究論文。該研究通過建立能夠跨分化階段高通量譜系示蹤新技術(shù)——SISBAR，解析了人多能干細(xì)胞分化為人腹側(cè)中后腦神經(jīng)細(xì)胞的單細(xì)胞譜系，發(fā)現(xiàn)了許多新的譜系分化路徑和分子調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步展示了基于SISBAR技術(shù)的新發(fā)現(xiàn)在改進(jìn)帕金森癥細(xì)胞治療策略中的應(yīng)用。SISBAR技術(shù)有望為干細(xì)胞研究帶來新突破。
 

　　發(fā)育與干細(xì)胞生物學(xué)中的基礎(chǔ)性問題之一是如何解析生物體內(nèi)不同細(xì)胞類型之間的發(fā)育譜系關(guān)系。解析這些譜系關(guān)系能夠更加深入地解析生命體的正常發(fā)育過程以及病理狀態(tài)(包括癌癥與發(fā)育障礙)下的分子機(jī)制，為操縱在體細(xì)胞分化命運(yùn)，優(yōu)化體外細(xì)胞分化方法，以及促進(jìn)基于細(xì)胞替代療法的再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供線索。然而，經(jīng)典的正向譜系追蹤和逆向譜系追蹤方法，主要用于解析同一個(gè)分化/發(fā)育時(shí)間點(diǎn)不同細(xì)胞類型之間的譜系關(guān)系，而不能同時(shí)提供在上一個(gè)階段與它們有親緣關(guān)系的前體細(xì)胞的身份特征。如何持續(xù)地追蹤細(xì)胞在多個(gè)分化/發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞狀態(tài)，從而描繪更完整的細(xì)胞發(fā)育路徑，是發(fā)育學(xué)領(lǐng)域中亟待解決的問題。
 

　　針對(duì)以上問題，該團(tuán)隊(duì)通過結(jié)合病毒介導(dǎo)的細(xì)胞條形碼標(biāo)記技術(shù)、單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)以及克隆分離策略，開發(fā)了SISBAR技術(shù)，并應(yīng)用在基于人多能干細(xì)胞的神經(jīng)分化模型中。SISBAR技術(shù)可以跨分化階段追蹤單個(gè)前體細(xì)胞衍生的譜系克隆，同時(shí)獲取該前體細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組信息(圖A)。該團(tuán)隊(duì)一直致力于人多能干細(xì)胞神經(jīng)分化技術(shù)的開發(fā)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞治療研究，建立了將人多能干細(xì)胞分化為人腹側(cè)中腦和后腦細(xì)胞的方法，其中包含可用于帕金森癥細(xì)胞替代療法的關(guān)鍵細(xì)胞類型——中腦多巴胺能神經(jīng)元(Cell Stem Cell 2016；Cell Stem Cell 2021；JCI 2022)。
 

　　科研團(tuán)隊(duì)將SISBAR技術(shù)應(yīng)用于人腹側(cè)中后腦的體外分化體系，建立了“潛能視角”“起源視角”的譜系分析方法來分別解析由轉(zhuǎn)錄組定義的不同細(xì)胞類型的分化潛能及分化起源，從而構(gòu)建了一個(gè)多層級(jí)的譜系樹來描繪整個(gè)分化過程(圖B)。這一多層級(jí)譜系樹揭示了中后腦細(xì)胞分化過程中許多之前未被報(bào)道的發(fā)散型和匯聚型跨階段譜系分化路徑。該研究還揭示了跨分化階段的群體水平譜系和克隆水平譜系之間的關(guān)系：在發(fā)散型譜系關(guān)系中，同種類型的前體細(xì)胞(單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組定義的細(xì)胞簇)中單個(gè)前體細(xì)胞的命運(yùn)可以不同；不同前體細(xì)胞差異的分化命運(yùn)的集合代表了該前體細(xì)胞類型在群體水平的分化命運(yùn)。在匯聚型譜系關(guān)系中，研究發(fā)現(xiàn)同種類型子代細(xì)胞中的單個(gè)細(xì)胞可以有不同的譜系起源，且這些不同來源的子代細(xì)胞會(huì)帶有其親代細(xì)胞獨(dú)特的基因印跡(圖C-D)。
 

　　研究進(jìn)一步展示了基于SISBAR技術(shù)的跨分化階段譜系關(guān)系和相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制的解析在神經(jīng)系統(tǒng)疾病細(xì)胞治療中的應(yīng)用。利用SISBAR技術(shù)，研究發(fā)現(xiàn)中腦多巴胺能神經(jīng)前體細(xì)胞具有至少三種命運(yùn)分化潛能，包括中腦多巴胺能神經(jīng)元、中腦谷氨酸能神經(jīng)元、血管軟腦膜樣細(xì)胞(VLMCs)。研究還鑒定了早期中腦多巴胺能神經(jīng)前體細(xì)胞的特異性表面分子標(biāo)記物APCDD1(圖E)。研究顯示，將表達(dá)APCDD1的神經(jīng)前體細(xì)胞進(jìn)行流式分選并移植到帕金森病模型小鼠的紋狀體后，移植物中目的細(xì)胞-中腦多巴胺能神經(jīng)元的比例得到顯著提高(圖F)。同時(shí)，與通過SISBAR技術(shù)發(fā)現(xiàn)的中腦多巴胺能神經(jīng)前體細(xì)胞多分化潛能的結(jié)果一致，研究在APCDD1分選的移植物中檢測(cè)到中腦谷氨酸能神經(jīng)元和一種血管軟腦膜樣細(xì)胞，這展示了SISBAR技術(shù)在改進(jìn)細(xì)胞治療策略和預(yù)測(cè)移植細(xì)胞體內(nèi)分化命運(yùn)中的應(yīng)用。
 

　　基于人多能干細(xì)胞的細(xì)胞替代療法在治療許多用傳統(tǒng)藥物難以治愈的疾病(如帕金森癥)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，人多能干細(xì)胞分化得到的供體細(xì)胞(細(xì)胞藥物)存在顯著的異質(zhì)性，這將導(dǎo)致供體細(xì)胞和移植物中目的細(xì)胞的低比例和細(xì)胞組成的不穩(wěn)定性，阻礙了細(xì)胞替代療法在臨床上更廣泛地應(yīng)用?？梢灶A(yù)見的是，作為一種通用型技術(shù)，SISBAR能夠廣泛地應(yīng)用于包括神經(jīng)分化在內(nèi)的基于人多能干細(xì)胞的體外分化系統(tǒng)中，構(gòu)建整個(gè)分化過程的譜系發(fā)育樹，解析譜系分化的分子調(diào)控機(jī)制，使我們更好地探討目的細(xì)胞和非目的細(xì)胞在分化過程中產(chǎn)生的機(jī)制，從而改進(jìn)細(xì)胞治療策略，獲得更安全穩(wěn)定的細(xì)胞治療結(jié)果。同時(shí)，SISBAR還為我們解析細(xì)胞分化/發(fā)育過程中的譜系關(guān)系提供了新的方法和視角，是經(jīng)典譜系追蹤方法的重要補(bǔ)充。本研究中群體水平譜系和克隆水平譜系關(guān)系的解析，為探索細(xì)胞分化分過程中復(fù)雜而精確的細(xì)胞命運(yùn)決定事件奠定了重要的理論基礎(chǔ)。
 

　　研究工作得到中科院、科技部、國家自然科學(xué)基金和上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)的支持。
 

　　(A)用于跨時(shí)間點(diǎn)克隆譜系追蹤的SISBAR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。(B)跨越四個(gè)分化階段多層級(jí)譜系樹，展示了不同分化時(shí)間段不同細(xì)胞類型之間顯著的遺傳譜系關(guān)系。(C-D)兩種不同的匯聚型譜系分化路徑示意圖。(E)特異性表達(dá)在中腦多巴胺能神經(jīng)元早期前體細(xì)胞中的基因。(F)未分選的神經(jīng)前體細(xì)胞和APCDD1+神經(jīng)前體細(xì)胞衍生的移植物典型圖和移植物中TH+神經(jīng)元的比例，hN，人源細(xì)胞核。比例尺，大圖中為100 μm，小圖中為20 μm。