【儀表網(wǎng) 儀表標(biāo)準(zhǔn)】為貫徹《中華人民共和國(guó)環(huán)境保護(hù)法》，規(guī)范生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)工作，生態(tài)環(huán)境部現(xiàn)批準(zhǔn)《水質(zhì) 滅菌生物指示物(枯草芽孢桿菌黑色變種)的鑒定 生物學(xué)檢測(cè)法》標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家生態(tài)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)，并予發(fā)布。本標(biāo)準(zhǔn)自2022年4月1日起實(shí)施。
 

　　為貫徹《中華人民共和國(guó)環(huán)境保護(hù)法》《中華人民共和國(guó)水污染防治法》，防治生態(tài)環(huán)境污染，改善生態(tài)環(huán)境質(zhì)量，規(guī)范水中滅菌生物指示物(枯草芽孢桿菌黑色變種)的鑒定方法，制定本標(biāo)準(zhǔn)。
 

　　本標(biāo)準(zhǔn)為首次發(fā)布。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鑒定水中滅菌生物指示物(枯草芽孢桿菌黑色變種)的生物學(xué)方法，用于微生物實(shí)驗(yàn)室滅菌效果的評(píng)價(jià)。
 

　　本標(biāo)準(zhǔn)引用了下列文件或其中的條款。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是未注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本標(biāo)準(zhǔn)?！断炯夹g(shù)規(guī)范》(原衛(wèi)生部衛(wèi)法監(jiān)發(fā)〔2002〕282 號(hào))。
 

　　方法原理：
 

　　經(jīng)滅菌處置后含枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢的水樣通過(guò)孔徑為 0.45 μm 的濾膜過(guò)濾，細(xì)菌和芽孢被截留在濾膜上，然后將濾膜置于酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基上，36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 72 h～96 h，枯草芽孢桿菌黑色變種產(chǎn)生的酪氨酸酶可分解并利用酪氨酸形成黑色素，產(chǎn)生黑色的特征菌落。對(duì)特征菌落進(jìn)行染色鏡檢后通過(guò)生化試驗(yàn)做進(jìn)一步鑒定，能利用甘油和甘露糖，可還原硝酸鹽和水解淀粉，不能利用苦杏仁苷和甘露醇，并確認(rèn)為革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌的特征菌落為枯草芽孢桿菌黑色變種，鑒定結(jié)果為陽(yáng)性。
 

　　儀器和設(shè)備：
 

　　1. 樣品瓶：螺口帶蓋或磨口具塞的 250 ml、500 ml 廣口玻璃瓶。
 

　　2. 恒溫培養(yǎng)箱：36 ℃±1 ℃。
 

　　3. 高壓蒸汽滅菌器：121 ℃，可調(diào)。
 

　　4. pH 計(jì)：準(zhǔn)確到 0.1 pH 單位或更高精度。也可使用 pH 精密試紙。
 

　　5. 顯微鏡：物鏡 4×或 5×、10×、20×、40×，油鏡 100×，目鏡 10×或 15×。
 

　　6. 分析天平：實(shí)際分度值 0.0001 g。
 

　　7. 培養(yǎng)皿：直徑 90 mm。
 

　　8. 過(guò)濾裝置：配有砂芯濾器、圓筒形玻璃漏斗和真空泵，抽濾壓力不低于-50 kPa。
 

　　9. 接種環(huán)：直徑 1 mm～3 mm。
 

　　10. 鑷子：不銹鋼或一次性無(wú)菌塑料鑷子。
 

　　11. 刻度移液管：1 ml、10 ml。也可使用可調(diào)式移液器。
 

　　12. 量筒：100 ml。 6.13 錐形瓶：100 ml。 6.14 酒精燈。
 

　　15. 試管：10 ml。 6.16 無(wú)菌操作設(shè)備：無(wú)菌室、超凈工作臺(tái)、生物安全柜。
 

　　17. 一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。
 

　　樣品采集：
 

　　評(píng)價(jià)使用高溫高壓滅菌設(shè)備的滅菌效果時(shí)，取樣品瓶，加入枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸液及 200 ml 無(wú)菌水使混合液中枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢終濃度達(dá)到 5×104 CFU/ml～ 5×105 CFU/ml。滅菌處置完畢后，取出樣品瓶，對(duì)水樣進(jìn)行滅菌生物指示物(枯草芽孢桿菌黑色變種)的檢測(cè)。
 

　　評(píng)價(jià)使用其它滅菌設(shè)備的滅菌效果時(shí)，滅菌前取適量枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸液加入滅菌設(shè)備，使水樣中枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢終濃度達(dá)到 5×104 CFU/ml～5×105 CFU/ml。滅菌處置完畢后，從滅菌設(shè)備中采集水樣，進(jìn)行滅菌生物指示物(枯草芽孢桿菌黑色變種)的檢測(cè)。采樣量一般為樣品瓶容量的 80%左右，不得用樣品洗滌樣品瓶。樣品采集完畢后，迅速用無(wú)菌包裝紙包扎樣品瓶。

 

　　本標(biāo)準(zhǔn)適用于微生物實(shí)驗(yàn)室滅菌效果的評(píng)價(jià)。