PCR又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，PCR的過(guò)程可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)，是能將微量的DNA大幅增加。關(guān)于熱循環(huán)時(shí)間的另一個(gè)重要考慮是兩條引物 之間的距離;距離越遠(yuǎn)，合成靶序列全長(zhǎng)所需的時(shí)間也越長(zhǎng)，前文給出的反應(yīng)時(shí)間是按適于合成長(zhǎng)度500bp的靶序列擬定的。下面就各種溫度設(shè)置技巧分享。

1. 模板變性溫度

變性溫度是決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA 解鏈的溫度，達(dá)不到變性溫度就不會(huì)產(chǎn)生單鏈DNA模板，PCR也就不會(huì)啟動(dòng)。變性溫度低則變性不完、全，DNA雙鏈會(huì)很快復(fù)性，因而減少產(chǎn)量。一般取90～95℃。樣品一旦到達(dá)此溫度宜迅速冷卻到退火溫度。DNA變性只需要幾秒種，時(shí)間過(guò)久沒(méi)有必要;反之，在高溫時(shí)間應(yīng)盡量縮短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高變性溫度不宜超過(guò)95℃。

2. 引物退火溫度

退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量;溫度高特異性強(qiáng)，但過(guò)高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴(kuò)增效率下降;溫度低產(chǎn)量高，但過(guò)低可造成引物與模板錯(cuò)配，非特異性產(chǎn)物增加。一般先由37℃反應(yīng)條件開(kāi)始，設(shè)置一系列對(duì)照反應(yīng)，以確定某一特定反應(yīng)的最適退火溫度。也可根據(jù)引物的(G+C)%含量進(jìn)行推測(cè)，把握試驗(yàn)的起始點(diǎn)，一般試驗(yàn)中退火溫度Ta(annealing temperature)比擴(kuò)增引物的融解溫度TTm(melting temperature)低5℃，可按公式進(jìn)行計(jì)算：

Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃

其中A，T，G，C分別表示相應(yīng)堿基的個(gè)數(shù)。例如，20個(gè)堿基的引物，如果(G+C)%含量為50%時(shí)，則Ta的起點(diǎn)可設(shè)在55℃。在典型的引物濃度時(shí)(如0.2μmol/L),退火反應(yīng)數(shù)秒即可完成，長(zhǎng)時(shí)間退火沒(méi)有必要。