實(shí)驗(yàn)原理:

傳代培養(yǎng)是組織培養(yǎng)常規(guī)保種方法之一。也是幾乎所有細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)滿后就需要將其稀釋分種成多瓶，細(xì)胞才能繼續(xù)生長(zhǎng)。這一過(guò)程就叫傳代。傳代培養(yǎng)可獲得大量細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)所需。傳代要在嚴(yán)格的無(wú)菌條件下進(jìn)行，每一步都需要認(rèn)真仔細(xì)的無(wú)菌操作。

實(shí)驗(yàn)步驟:

1.入無(wú)菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒雙手。

2.倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是否需要傳代及細(xì)胞需要稀釋的倍數(shù)。將培養(yǎng)用液置37℃下預(yù)熱。

3.超凈臺(tái)臺(tái)面應(yīng)整潔，用0.1%新潔爾滅溶液擦凈。

4.打開超凈臺(tái)的紫外燈照射臺(tái)面20min左右，關(guān)閉超凈臺(tái)的紫外燈，打開抽風(fēng)機(jī)清潔空氣，除去臭氧。

5.點(diǎn)燃酒精燈;取出無(wú)菌試管，巴斯德吸管和刻度吸管;安上橡皮頭;過(guò)酒精燈火焰略燒后插在無(wú)菌試管內(nèi)。

6.將培養(yǎng)用液瓶口用75%酒精消毒，過(guò)酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。

7.倒掉培養(yǎng)細(xì)胞的舊培養(yǎng)基。酌情可用2-3mLHanks液洗去殘留的舊培養(yǎng)基，或用少量yi酶涮洗一下。

8.每個(gè)大培養(yǎng)瓶加入1mLyi酶，小瓶用量酌減，蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞收回突起變圓時(shí)立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫離yi酶，然后將yi酶倒掉。注意勿使細(xì)胞提早脫落入消化液中。

9.加入少量的含血清的新鮮培養(yǎng)基，反復(fù)吹打消化好的細(xì)胞使其脫壁并分散，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補(bǔ)加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)基(7~10mL/大瓶，3~5mL/小瓶)制成細(xì)胞懸液，然后分裝到新培養(yǎng)瓶中。蓋上瓶蓋，適度擰緊后再稍回轉(zhuǎn)，以利于CO?氣體的進(jìn)入，將培養(yǎng)瓶放回CO?培養(yǎng)箱。

10.對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，步驟7-9不做?？蓪⒓?xì)胞懸液進(jìn)行離心去除舊培養(yǎng)基上清，加入新鮮培養(yǎng)基，然后分裝到各瓶中。