elisa試劑盒人防御素(Human defensins)屬于抗菌肽家族,是人體內(nèi)源免疫系統(tǒng)的重要組成部分。

人防御素具有廣泛的抗菌譜,而且致病微生物不易對它產(chǎn)生耐藥性,因此有很好的藥用前景。

本文建立在實(shí)驗(yàn)室關(guān)于人B防御素2的成果基礎(chǔ)上,考察了人β防御素3(HBD3)和人β防御素4(HBD4)的表達(dá)條件,人β防御素4的分離和純化以及重組人β防御素4的抑菌活性。

本文利用進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的人β防御素4表達(dá)菌種BL21(DE3)/pET32-smHBD4,考慮誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑量、誘導(dǎo)時機(jī)、表達(dá)時間等因素,進(jìn)行搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化。

獲得優(yōu)化培養(yǎng)條件:誘導(dǎo)溫度為34℃,IPTG量為0.4 mM,誘導(dǎo)時機(jī)為對數(shù)生長期中期,誘導(dǎo)后表達(dá)6hour終止。通過條件優(yōu)化,目標(biāo)蛋白融合蛋白TrxA—HBD4產(chǎn)量可達(dá)2.68g/l左右(即成熟的HBD4可達(dá)0.69g/l),目標(biāo)融合蛋白占可溶蛋白65%左右。

隨后,文章對所得重組人β防御素4(HBD4)的分離純化工藝進(jìn)行了探索,在經(jīng)過Ni離子親和層析,腸激酶酶切,陽離子交換層析,凝膠脫鹽和冷凍干燥一系列處理后,獲得了純度為95%的重組HBD4,整個分離工藝流程回收率為53%。

接著,本文對重組HBD4的抑菌活性進(jìn)行了考察,通過固體平板擴(kuò)散法觀察到了重組HBD4對綠膿桿菌P.aeruginosa ATCC27853和大腸桿菌E.coli K12D31的抑菌活性;采用液體培養(yǎng)法,考察了重組HBD4濃度與其對大腸桿菌E.coli K12 D31的抑菌活性的關(guān)系,并繪制了殺菌曲線。

此外,論文還對人β防御素3的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化,獲得優(yōu)化條件:誘導(dǎo)溫度為34℃,IPTG量為0.4 mM,誘導(dǎo)時機(jī)為對數(shù)生長期中期,表達(dá)時間為8hour。

通過條件優(yōu)化,目標(biāo)蛋白融合蛋白TrxA—HBD3產(chǎn)量可達(dá)2.55g/l左右(即成熟的HBD3可達(dá)0.56g/l),目標(biāo)融合蛋白占可溶蛋白66%左右。
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