細(xì)胞簡(jiǎn)介：

小鼠胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層分離自胎盤組織；胎盤（placenta）是哺乳動(dòng)物妊娠期間由胚胎的胚膜和母體子宮內(nèi)膜聯(lián)合長(zhǎng)成的母子間交換物質(zhì)的過渡性器官，由羊膜、葉狀絨毛膜和底蛻膜構(gòu)成。胎兒在子宮中發(fā)育，依靠胎盤從母體取得營(yíng)養(yǎng)，而雙方保持相當(dāng)?shù)莫?dú)立性。胎盤還產(chǎn)生多種維持妊娠的激素，是一個(gè)重要的內(nèi)分泌器官。有些爬行類和魚類也以胎生方式繁殖后代，胚胎生長(zhǎng)出一些輔助結(jié)構(gòu)如卵黃囊、鰓絲等與母體組織緊密結(jié)合，以達(dá)到母子間物質(zhì)的交換，這樣的結(jié)構(gòu)稱假胎盤。絨毛膜是由滋養(yǎng)層和胚外中胚層的壁層構(gòu)成。胚泡植入子宮內(nèi)膜后，在胚泡表面形成許多絨毛樣的突起，以細(xì)胞滋養(yǎng)層為中軸，外裹合體滋養(yǎng)層，稱初級(jí)干絨毛。胚外中胚層長(zhǎng)入初級(jí)干絨毛的中軸，使初級(jí)干絨毛變成了次級(jí)干絨毛。當(dāng)絨毛膜的胚外中胚層內(nèi)形成血管網(wǎng)和結(jié)締組織，并與胚體內(nèi)的血管相通時(shí)，次級(jí)干絨毛改稱三級(jí)干絨毛。三級(jí)干絨毛末端的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞形成細(xì)胞滋養(yǎng)層殼。隨著胚胎發(fā)育，叢密絨毛膜與基蛻膜共同構(gòu)成了胎盤，而平滑絨毛膜則和包蛻膜一起逐漸與壁蛻膜融合。
方法簡(jiǎn)介：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的小鼠胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層采用yi蛋白酶-DNA酶聯(lián)合消化法結(jié)合密度梯度離心法制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。
質(zhì)量檢測(cè)：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的小鼠胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層經(jīng)Cytokeratin-7免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

1) 將5-10d的乳鼠浸泡入75%乙醇中，移入生物安全柜，

2) 從胸部解剖乳鼠，取出雙肺置于預(yù)冷的PBS中，盡可能的除去結(jié)締組織等，

3) 取肺邊緣部分，剪碎，將組織塊移入T25培養(yǎng)瓶中，倒置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，

4) 2h后，培養(yǎng)瓶中注入2 mL內(nèi)皮培養(yǎng)基，小心將培養(yǎng)瓶正置于培養(yǎng)箱，確保組織塊不會(huì)飄起來，

5) 每3d換液2mL，待細(xì)胞從組織塊中爬出來后，隔2d換液，待細(xì)胞融合達(dá)到60-70%左右時(shí)，去除組織塊，將肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞重新鋪瓶。

1、您收到細(xì)胞后，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作：

取出T-25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置4-6小時(shí)或過夜，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，然后換用新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)或進(jìn)行傳代。

2、細(xì)胞傳代：

1）細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2）添加0.125%消化液約2ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1500rpm/min，離心5min；

3）棄上清，沉淀細(xì)胞用12ml培養(yǎng)基重懸，然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代，放入37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4）待細(xì)胞貼壁后，觀察培養(yǎng)結(jié)果，之后進(jìn)行換液培養(yǎng)或傳代。

3、細(xì)胞凍存：

1）細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2）添加0.125%消化液約2ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，再加入培養(yǎng)液終止消化，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1500rpm/min，離心5min；

3）用適當(dāng)量的凍存液（基礎(chǔ)培養(yǎng)基：FBS：DMSO=7:2:1）重懸細(xì)胞，并放置于凍存管中；

4）先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃ 1.5h，然后將其移入-80℃過夜，24h后轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。

4、細(xì)胞復(fù)蘇：

1）從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具）， 快速將其置入37℃水浴中解凍，直至凍存管中無結(jié)晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；

2）將凍存管中的細(xì)胞移至15ml無菌離心管中，滴加入培養(yǎng)液5ml混勻細(xì)胞，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至適當(dāng)面積大小的培養(yǎng)皿中；

3）放置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4）第二天，換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。