什么是腫瘤細胞培養(yǎng)?
顧名思義，從體內(nèi)分離出來的組織或細胞的*次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。更成熟的概念是，凡是來源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細胞稱之為原代細胞。細胞的純化或細胞克隆技術(shù)是細胞培養(yǎng)工作的基礎。
原代細胞培養(yǎng)的原理
將動物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶(常用*)、螯合劑(常用EDTA)或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。

原代細胞培養(yǎng)的應用
(1)為研究生物體細胞的生長、代謝、繁殖提供有力的手段;
(2)為傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件;
(3)服務于臨床實踐，用于藥物篩選等。

原代細胞培養(yǎng)的步驟：取材→分離→培養(yǎng)和維持
1、取材
人和動物細胞的取材是原代細胞培養(yǎng)成功的首要條件，直接影響細胞的體外培養(yǎng)。
(1) 取材的基本要求
① 取材要注意新鮮和保鮮
② 應嚴格無菌
③ 防止機械損傷
④ 去除無用組織和避免干燥
⑤ 應注意組織類型、分化程度、年齡等
⑥ 作好記錄

(2)各類組織的取材技術(shù)
① 皮膚和粘膜的取材
主要取自于手術(shù)過程中的皮片，方法似外科取斷層皮片手術(shù)操作，但面積一般2~4平方厘米。
② 內(nèi)臟和實體瘤的取材
內(nèi)臟除消化道外基本是無菌的，但取材時要明確和熟悉所需組織的類型和部位，實體瘤取材時要取腫瘤細胞豐富的區(qū)域，要避開破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結(jié)締組織。
③ 血液細胞的取材
血細胞、淋巴細胞的取材，一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中(如脾、扁桃體、胸腺、淋巴結(jié)等)分離細胞，取材時應注意抗凝。
④ 骨髓、羊水、胸/腹水細胞取材
嚴格無菌，注意抗凝，還要盡快分離培養(yǎng)，離心后，用無鈣、鎂PBS洗兩次，再用培養(yǎng)液洗一次后即可培養(yǎng)，不宜低溫存放。
⑤ 動物組織取材
I 鼠胚組織取材
首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動物，然后將其整個浸泡在含有75%酒精的燒杯中，5分鐘后(注意時間不能太長，以避免酒精從口或其他通道進入體內(nèi)，影響組織活力)，取出動物，在消毒過的木板上可用無菌的圖釘或大頭針固定四肢，切開皮膚，用無菌操作法解剖取胚或用無菌*挾起皮膚、用無菌眼科剪沿軀干中部環(huán)形剪開皮膚，用*分別挾住兩側(cè)皮膚拉向頭尾，把動物反包，暴露軀干，然后再固定，更換無菌解剖器材，采用無菌操作法解剖取出胚胎。
II 幼鼠胚腎(或肺)取材
幼鼠采用上述方法處死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切開游離毛皮并拉開至兩側(cè)：然后采用無菌法打開胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先將背部毛皮切開游離并拉向兩側(cè)，然后采用無菌法從背部打開腹腔取腎。
⑥ 雞(鴨)鳥類胚胎組織取材步驟
1、取孵化至適當胚齡(9~12天)的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管、胚體有運動的胚蛋，說明胚體發(fā)育良好，并用有色筆劃出氣室和胚體位置。
2、將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼，再用75%酒精棉球擦干;
經(jīng)碘酒、75%酒精消毒后，在無菌條件下采用無菌法用剪刀或鑷子打開氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼;
3、用*撕去殼膜，暴露出雞胚;
4、用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無菌平皿中，解剖取材。

2、分離
人或動物體內(nèi)(或胚胎組織)由于多種細胞結(jié)合緊密，不利于各個腫瘤細胞在體外培養(yǎng)中生長繁殖，必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開，使細胞解離出來。
(1)懸浮細胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，zui簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經(jīng)離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細胞。
(2)實體組織材料的分離方法
對于實體組織材料，由于細胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，可采用機械分散法(物理裂解)和消化分離法。
① 機械分散法
特點:簡便、快速,但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差,適用于處理纖維成分少的軟組織。
② 消化分離法
組織消化法是把*切成較小團塊(或糊狀)，應用酶的生化作用和非酶的化學作用進一步使細胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，制成少量細胞群團和大量單個細胞的細胞懸液，接種培養(yǎng)后，細胞容易貼壁生長。
Ⅰ 酶消化分離法
酶消化分離法常采用*(Corning 25-053-CI)和膠原酶(Sigma/Life)
*分散原理：*是一種胰臟制品，對蛋白質(zhì)有水介作用，主要作用于賴氨酸或*相連接的肽鍵，使細胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細胞分散開。
影響*作用的主要因素：
細胞類型、酶的活力、酶的濃度、溫度、pH、無機鹽離子、消化時間
膠原酶(Collagenase，Sigma)消化法
膠原酶是一種從細菌中提取出來的酶，對膠原有很強的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對細胞間質(zhì)有較好的消化作用。

Ⅱ 非酶消化法(EDTA消化法)
EDTA是一種非酶消化物，又稱螯合劑或Versene，全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好，該化學物質(zhì)能與細胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物，利用結(jié)合后的機械力使細胞變圓而分散細胞或使貼壁細胞從瓶壁上脫離。
Ⅲ 消化分離法的操作步驟
剪切.加液漂洗.消化.棄去消化液.漂洗.機械分散
Ⅳ 消化分離法的注意事項
組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對*和EDTA的抑制作用。
胰蛋白濃度不宜過高，作用時間不能太長，以避免毒性作用。
消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生，而且動作要輕，避免膨松的細胞隨漂洗而丟失。

3、原代細胞的培養(yǎng)和維持
(1)原代細胞的培養(yǎng)方法
原代細胞的培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng)是從供體取得組織細胞在體外進行的培養(yǎng)，是建立細胞系的*步，是一項基本技術(shù)。
原代細胞zui接近和zui能反映體內(nèi)生長特性，適宜用于藥物敏感性試驗、細胞分化等實驗研究。
① 組織塊培養(yǎng)法
組織塊培養(yǎng)是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法。其基本方法是將剪成的小組織團塊接種于培養(yǎng)瓶(或皿)中，瓶壁可預先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著于瓶壁，使周邊細胞能沿瓶壁向外生長。
② 消化培養(yǎng)法
③ 懸浮細胞培養(yǎng)法
對于懸浮生長的細胞，如白血病細胞、淋巴細胞、骨髓細胞、胸水和腹水中的癌細胞和免疫細胞無需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細胞分層液分離后接種培養(yǎng)。
④器官培養(yǎng)
器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織塊后，不進行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)，器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對完整性，可用于重點觀察細胞間的、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。

(2)原代細胞的培養(yǎng)條件
① 靜置貼壁細胞(包括半貼壁細胞的培養(yǎng))培養(yǎng)
a 細胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性
b 細胞接種時濃度要稍大一些，至少為5×108細胞/L。
c 培養(yǎng)基可用Eagle(MEM Corning 10-010-CVR)或DMEM(Corning 10-013-CVR)培養(yǎng)。
d 胎牛血清濃度為10%-80%。
e 應在37℃5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。。
f 在起始的2天中盡量減少振蕩，以防止剛貼壁的細胞發(fā)生脫落，漂浮。
g 待細胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，應將原代細胞換液
h 用骨髓或外周血中的懸浮細胞經(jīng)靜置培養(yǎng)1周時，應將細胞懸液經(jīng)低速離心后換液。

② 懸浮細胞的培養(yǎng)要求
a 原代培養(yǎng)時要盡量去除紅細胞
b 短期培養(yǎng)，可在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進行
c 細胞濃度可在5-8×109/L范圍內(nèi)，進行分瓶試驗。
d *培養(yǎng)時，淋巴細胞中要加入生長因子，白血病細胞中要加入少量的原患者血清，以利細胞生長。
f 細胞換液一般每隔3天需半量換液一次
g 腫瘤細胞傳代一般待細胞增殖加快、細胞密度較高時才能進行。