5hmC- 哺乳動物DNA中的“第六堿基”

早在上世紀70年代，Penn等人發(fā)現(xiàn)在哺乳動物DNA中存在5-羥甲基化胞嘧啶（5hmC）(Penn et al., 1972)。然而該發(fā)現(xiàn)并未得到反復證實(Kothari and Shankar, 1976)，因而5hmC也沒有受到應有的重視。直到2009年，Kriaucionis 和Tahiliani兩位科學家證實小鼠的Purkinje細胞，顆粒神經(jīng)元以及胚胎干細胞存在5hmC (Kriaucionis and Heintz, 2009; Tahiliani et al., 2009)。此外，在哺乳動物的其他組織中同樣檢測到大量5hmC的存在 (Globisch et al., 2010)。其中5hmC在中樞神經(jīng)和脊髓中含量zui高(0.3-0.7%)，在腎臟、鼻上皮細胞、膀胱、心臟、骨骼肌和肺部的含量居中(0.15 -0.17%)，而肝臟、脾臟和內(nèi)分泌腺中的含量zui低(0.03-0.06%)。宋紅軍等人利用敏感度更高的5hmC化學標記法對HeLa和HEK293細胞檢測發(fā)現(xiàn)，5hmC大約占總核苷酸的0.001% (Song et al., 2011)。

5甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?羥甲基胞嘧啶的途徑

DNA氧化損傷能產(chǎn)生各種修飾堿基，如*可被氧化成為8-氧橋*，5甲基胞嘧啶可被氧化生成5羥甲基胞嘧啶。因此，某些細胞中的5hmC很可能就是環(huán)境氧化壓力所造成的。但是Kriaucionis和Heintz的發(fā)現(xiàn)表明5hmC的存在并未伴隨有其他損傷產(chǎn)物的積累，并且Purkinje細胞和顆粒細胞中的5hmC總量與小鼠的年齡也不存在必然的(Kriaucionis and Heintz, 2009)。新近發(fā)現(xiàn)的TET蛋白家族使人們對5hmC有了更深入的了解：TET是一種能夠催化5甲基胞嘧啶產(chǎn)生5羥甲基胞嘧啶的加氧酶。TET蛋白家族有3個成員，分別是Tet1，Tet2和Tet3。它們都含有一個序列保守的C-端催化結(jié)構(gòu)域 (Ito et al., 2010; Tahiliani et al., 2009)，并具有2-氧化戊二酸和2價鐵原子依賴型雙加氧酶的典型特征(Aravind and Koonin, 2001; Loenarz and Schofield, 2009)。

*圖釋：哺乳動物DNA中的胞嘧啶種類。胞嘧啶是DNA復制的原料之一；5甲基胞嘧啶則是DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT以S-腺苷*(SAM)為甲基供體催化胞嘧啶形成的；5羥甲基胞嘧啶是在TET蛋白作用下形成的，TET利用氧分子使羥基轉(zhuǎn)移到5甲基胞嘧啶上。

5hmC的生物學作用

5hmC可影響長期和短期的基因表達調(diào)控，因此在體內(nèi)可能具有重要的生物學意義。由于維持性甲基化酶DNMT1不能識別羥甲基化胞嘧啶，甲基化胞嘧啶所轉(zhuǎn)化的羥甲基胞嘧啶可能有助于DNA進行被動去甲基化。維持性甲基化的保真度即使只發(fā)生微弱的降低就足以導致多次細胞分裂的過程中CpG的甲基化水平呈指數(shù)級降低，從而實現(xiàn)被動性去甲基化。

*圖釋：5hmC 可能的生物學功能： DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）無法識別5hmC，因而5hmC在DNA復制過程中可以阻礙DNMT的維持性甲基化作用，zui終導致DNA的被動去甲基化。

在光氧化實驗或高pH條件下，5羥甲基胞嘧啶可通過去醛基產(chǎn)生胞嘧啶 (Privat and Sowers, 1996，Alegria, 1967; Flaks and Cohen, 1959)，這使得在特定細胞環(huán)境中5羥甲基胞嘧啶有可能轉(zhuǎn)變?yōu)榘奏?。一種可能性就是5羥甲基胞嘧啶作為主動去甲基化途徑中的一個關(guān)鍵中間體存在，而這種去甲基化途徑通常涉及到DNA的損傷修復機制(Tahiliani et al., 2009)。這種觀點也得到了一些證據(jù)的支持：早在1988年，cannon等人就報道了牛胸腺提取物存在特異修飾5hmC的糖基化酶(Cannon et al., 1988)。此外，還有報道表明一些DNA糖基化酶如TDG和MBD4參與了DNA去甲基化過程，但目前體外酶活性試驗尚未證實這些酶具有催化甲基胞嘧啶的活性。除此之外，hmC可以通過脫氨基作用生產(chǎn)去甲基化過程的中間產(chǎn)物hmU。因為在成纖維細胞中已經(jīng)檢測到了高活性的hmU:G的糖基化酶(Rusmintratip and Sowers, 2000)。

*圖釋：5hmC可能的生物學作用-5hmC可以被DNA修復酶識別，例如5hmC特異DNA糖基化酶(5hmC-DG)可以把羥甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)榘奏?，從而引起DNA的主動性去甲基化

作為一個潛在穩(wěn)定的堿基，5hmC也有可能通過募集5hmC結(jié)合蛋白或者排斥甲基化結(jié)合蛋白（MBPs）來影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄活性。而實驗結(jié)果也確實證明了甲基化結(jié)合蛋白MeCP2無法識別5hmC (Valinluck et al., 2004)。

*圖釋：5hmC可能生物學作用- 由于5hmC不能被甲基化結(jié)合蛋白（MBD1，MBD2，MBD4，MeCP2）所識別，這樣羥甲基化修飾的DNA就不能募集組蛋白去乙?；?，從而可以形成具有轉(zhuǎn)錄活性的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。

5hmC在基因組的分布以及與基因表達水平的關(guān)系

基因體（gene body）上的5hmC及其與基因表達水平的關(guān)系

大量研究表明，5hmC特異性地富集在基因體上(Jin et al., 2011; Pastor et al., 2011; Song et al., 2011; Xu et al., 2011)。進一步深入的研究發(fā)現(xiàn)基因內(nèi)部的5hmC含量往往可以表征基因表達的活性，這也與以前報道5hmC能夠促進或維持基因表達的結(jié)論一致(Jin et al., 2011; Song et al., 2011)。在一些沒有發(fā)生實質(zhì)性去甲基化（5mC轉(zhuǎn)變?yōu)?C）的過程中，5mC轉(zhuǎn)換成5hmC可能是起到類似DNA去甲基化的作用，即可以解除5mC對基因表達的抑制效應(Wu and Zhang, 2010)。然而，基因體5hmC的水平與基因表達高低也不是簡單的線性關(guān)系，Xu等人發(fā)現(xiàn)在組成型表達的基因如看家基因的基因體上5hmC含量很低。

啟動子區(qū)的5hmC及其與基因表達水平的關(guān)系

Song等人觀察到5hmC主要富集在如轉(zhuǎn)錄起始位點，轉(zhuǎn)錄終止位點和基因遠端等區(qū)域的上游和下游(Song et al., 2011)。進一步的分析揭示基因附近富含5hmC意味著這個基因表達水平較高。Ficz 等人的實驗結(jié)果也顯示出啟動子區(qū)5hmC的含量與轉(zhuǎn)錄水平具有明顯的正相關(guān)性。而且發(fā)現(xiàn)這種關(guān)系部分依賴于啟動子的CpG密度。5hmC似乎可以減輕部分5mC的沉默效應，因為啟動子區(qū)含有5hmC和5mC的基因轉(zhuǎn)錄活性比啟動子只有5mC的基因高。與這些觀察相符的是，富含5hmC的啟動子都有組蛋白激活的標志H3K4me3 ，而富含5mC的啟動子缺乏H3K4me3 標志(Ficz et al., 2011)。另外有趣的是，隨著胚胎干細胞分化，多能性相關(guān)基因包括Esrrb, Prdm14, Dppas, Klfz, TCL1 和ZFP43的啟動子區(qū)5hmC水平顯著下降，而5mC水平卻明顯增加(Ficz et al., 2011)。

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