做蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)的時候，有時候?qū)嶒?yàn)會覺得參考實(shí)驗(yàn)方法和ke隆的蛋白基因序列沒有問題，蛋白電泳就是沒有結(jié)果。今天就一起來探討一下蛋白質(zhì)不表達(dá)的原因有哪些呢？
1.載體構(gòu)建錯誤
這個屢見不鮮，很多新人經(jīng)常弄錯讀碼框。比如Qiagen的pQE系列載體，其ke隆位點(diǎn)常有一兩個堿基的區(qū)別；另外有些酶產(chǎn)生粘端有些酶產(chǎn)生平端，這些都容易導(dǎo)致讀碼框錯誤，從而表達(dá)不出來。
2.宿主菌選擇不當(dāng)
不同的宿主菌其基因型是不一樣的。有些經(jīng)過特殊修飾的載體，或者特殊用途的載體，或者有特殊啟動子的載體，必須選擇合適的宿主菌進(jìn)行表達(dá)。因此，當(dāng)你的蛋白沒有表達(dá)出來時，可以考慮更換宿主菌。
3.密碼子的使用頻率低
有些基因其本身含有許多稀有密碼子，尤其是起始密碼之后的15個堿基之內(nèi)的稀有密碼子，對蛋白表達(dá)有著很重要的影響。優(yōu)化密碼子對原核表達(dá)似乎效果很好，對真核表達(dá)系統(tǒng)未見得有很好的效果。曾經(jīng)有某人在畢赤酵母表達(dá)某蛋白兩年未果，試圖將密碼子優(yōu)化進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果還是沒有表達(dá)。一氣之下將該優(yōu)化的基因序列克隆到原核表達(dá)載體，表達(dá)量居然出奇地高！這是一個辛酸的笑話，但是一個真實(shí)的故事。但是有一點(diǎn)我可以有很大把握的說：對于真核表達(dá)，密碼子優(yōu)化只能起錦上添花的作用（確認(rèn)有表達(dá)，以此來提高表達(dá)量），而不能雪中送炭（沒有表達(dá)出來，通過密碼子優(yōu)化極有可能不奏效）。
4.質(zhì)粒不穩(wěn)定或者質(zhì)粒丟失
pET系統(tǒng)通常比較穩(wěn)定。但是你選用帶氨芐青霉su抗性的載體時，也許有可能產(chǎn)生β-lactamase降解了抗生素，使質(zhì)粒丟失。還有一種情況是表達(dá)重組的毒素蛋白，對宿主細(xì)胞也有毒性，造成質(zhì)粒丟失。這種情況多見于真核表達(dá)系統(tǒng)。
5.蛋白酶將蛋白降解了
這種情況常由重組蛋白本身的N-或C-端序列引起的。當(dāng)?shù)鞍譔-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或 Tyr這些氨基酸時，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端規(guī)則。N-端是Met時，大腸桿菌可以悄悄地把這個Met偷走，特別是Met后緊跟著一個帶小側(cè)鏈的氨基酸時。C-末端存在非極性氨基酸時，也容易導(dǎo)致蛋白被降解。C末端最后5個氨基酸是極性的或者帶電荷的，則不易被降解。
6.二級翻譯起始位點(diǎn)
這種情況見于你的序列里正好含有和核糖體結(jié)合位點(diǎn)一致的序列。那就怪不得人家了，核糖體會很高興地找到這個位點(diǎn)，然后開始翻譯，致使你的蛋白被截短，在電泳時看不到預(yù)期大小的片段。
7.SD序列
這個不陌生吧？考研時老師喜歡出名詞解釋，也難怪人家老是拿這個出題----SD序列和起始密碼子序列（80%是AUG，也有GUG的）之間的距離，對蛋白表達(dá)的效率也有著非常重要的影響。SD序列本身的組成對翻譯效率也有影響。有時為了減少包涵體的產(chǎn)生，還特別對SD序列進(jìn)行修飾呢！
8.mRNA的二級結(jié)構(gòu)
在克隆之前，你得看看你的序列里是否有和核糖體結(jié)合位點(diǎn)和/或翻譯起始位點(diǎn)互補(bǔ)的序列。如然，你最好進(jìn)行同義密碼子替換。否則由此形成的mRNA二級結(jié)構(gòu)，會讓翻譯嘎然而止的。
9.意外終止
這種情況見于PCR擴(kuò)增序列時，會和你開個不大不小的玩笑。比如它會將序列中間TAC突變?yōu)門AA，讓你的蛋白翻譯剎車。所以在進(jìn)行表達(dá)之前，一定要進(jìn)行測序，避免這種情況的發(fā)生。
10.轉(zhuǎn)錄終止子
轉(zhuǎn)錄終止子的存在可以促進(jìn)蛋白表達(dá)；但是缺少時就會造成“通讀”，沒完沒了地讀下去。這在pET系統(tǒng)里不成問題，因?yàn)樗诎谢虻南喾捶较蛴袀€選擇性的標(biāo)記基因。如果你的靶基因正好和這個標(biāo)記基因方向一致，那么你得看看你的靶基因后是否有個轉(zhuǎn)錄終止子。如果沒有的話，它們會競爭得天昏地暗，搶著生成mRNA和蛋白質(zhì)。
11.mRNA的不穩(wěn)定性
靶基因的mRNA常聚集于細(xì)胞內(nèi)。但是大腸菌的mRNA及其不穩(wěn)定。如果在mRNA的5"-非翻譯區(qū)和3‘-rho非依賴性終止子處插入穩(wěn)定結(jié)構(gòu)序列，可以促進(jìn)mRNA的穩(wěn)定性。尤其是5"末端要是有個不帶突出的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，能讓mRNA在胞漿內(nèi)無生命之虞。
12.檢測方法的可行性
有時候，蛋白的確表達(dá)了，只是表達(dá)量特別低，或者和雜帶靠得特別近，致使你錯誤地以為蛋白沒有表達(dá)。這時候，你可千萬別忘記了生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的兩大黃金準(zhǔn)則：對照和重復(fù)。說到對照，有很多層意思。最基本的意思是，要設(shè)立空載體對照。在真核系統(tǒng)表達(dá)的蛋白，常常量特別低。因此你不要老是想著WB和SDS-PAGE去檢測。這時候，你必須多看文獻(xiàn)，另辟蹊徑，從文獻(xiàn)中找找看這個蛋白有米有很特別的性質(zhì)----比如說如果它具有酶活性，那簡直就是便宜你了。還比如說，某些蛋白具有異樣性質(zhì)，比如說流感病毒的HA，你拿表達(dá)的不同梯度稀釋的蛋白做個血凝。如果發(fā)生血凝，并且呈現(xiàn)一定的梯度關(guān)系，那簡直就是板上釘釘?shù)氖虑榱恕?/span>
以上就是關(guān)于蛋白質(zhì)不表達(dá)的原因有哪些的問題解答。如果你想了解更多請咨詢百奧創(chuàng)新客服！
儀表網(wǎng)手機(jī)版
儀表網(wǎng)小程序
公眾號.jpg)
公眾號：ybzhan
掃碼關(guān)注視頻號
手機(jī)版
官方微信
采購中心
