小鼠原代胃Cajal間質(zhì)細(xì)胞操作要點(diǎn)

培養(yǎng)條件優(yōu)化

1. 培養(yǎng)基選擇與補(bǔ)充： 建議使用DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清（FBS），1%雙抗，以及以下關(guān)鍵生長(zhǎng)因子：

干細(xì)胞因子（SCF，50ng/ml）： 促進(jìn)ICC存活和增殖。

胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1，25ng/ml）： 增強(qiáng)細(xì)胞代謝活性。

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF，10ng/ml）： 維持ICC表型，抑制分化。

2. 培養(yǎng)環(huán)境： 將細(xì)胞置于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，保持濕度飽和。由于ICC對(duì)氧化應(yīng)激敏感，建議在培養(yǎng)箱中維持低氧條件（5% O2），以模擬其體內(nèi)微環(huán)境。

3. 換液頻率：換液應(yīng)在接種后24小時(shí)進(jìn)行，以去除未貼壁的細(xì)胞碎片。之后每2-3天換液一次，換液時(shí)保留約1/3舊培養(yǎng)基，以維持細(xì)胞分泌的自分泌因子。

細(xì)胞鑒定與功能檢測(cè)

1. 免疫熒光鑒定：使用特異性抗體標(biāo)記ICC的標(biāo)志物，如c-Kit（CD117）、ANO1（TMEM16A）和vimentin。建議進(jìn)行共標(biāo)實(shí)驗(yàn)，例如c-Kit/ANO1雙標(biāo)，以提高鑒定準(zhǔn)確性。

2. 電生理特性檢測(cè)： 采用膜片鉗技術(shù)記錄ICC的自發(fā)電活動(dòng)，觀察其起搏電流（如：周期性內(nèi)向電流）和慢波電位，這是ICC功能的重要指標(biāo)。

3. 鈣成像： 使用Fluo-4 AM等鈣離子熒光探針，檢測(cè)ICC內(nèi)鈣振蕩的頻率和幅度，評(píng)估其鈣信號(hào)傳導(dǎo)功能。

常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案

細(xì)胞貼壁率低：檢查膠原蛋白包被是否均勻，嘗試增加包被時(shí)間（4℃過(guò)夜）。亦可使用纖維連接蛋白（fibronectin）輔助包被。

細(xì)胞增殖緩慢： 確認(rèn)生長(zhǎng)因子活性，建議分裝保存避免反復(fù)凍融。檢查血清批次，必要時(shí)更換優(yōu)質(zhì)血清。

細(xì)胞表型丟失： 避免過(guò)度傳代（建議P3以內(nèi)），縮短消化時(shí)間，并定期進(jìn)行免疫熒光鑒定。

注意事項(xiàng)

無(wú)菌操作： ICC培養(yǎng)對(duì)無(wú)菌要求高，所有操作需在超凈臺(tái)內(nèi)完成，試劑需經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾。

輕柔操作： ICC細(xì)胞膜脆弱，吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡，建議使用寬口吸頭。

數(shù)據(jù)記錄： 詳細(xì)記錄細(xì)胞形態(tài)、增殖狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)參數(shù)，便于追溯問(wèn)題。