高效液相色譜儀的原理及應(yīng)用！
高效液相色譜儀的原理及應(yīng)用！
微生物菌種查詢網(wǎng)：高效液相色譜儀(HPLC)是應(yīng)用高效液相色譜原理，主要用于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)的、受熱不穩(wěn)定的和分子量大的有機(jī)化合物的儀器設(shè)備。它由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成。儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相，被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相) 內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中做相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，經(jīng)過反復(fù)多次的吸附- 解吸的分配過程，各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測(cè)器時(shí)，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。HPLC廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、食品科學(xué)、藥物研究以及環(huán)境研究中。
一、原理
儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入檢測(cè)系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相，被流動(dòng)相載入色譜柱（固定相）內(nèi)，由于樣本溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，經(jīng)過反復(fù)多次的“吸附-解吸”的分配過程，各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測(cè)器時(shí)，樣本濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式輸出檢測(cè)結(jié)果。
根據(jù)分離機(jī)制的不同，HPLC原理可分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法及分子排阻色譜法。
1. 液固吸附色譜法
液固吸附色譜法中，固定相為固體吸附劑，根據(jù)各組分吸附能力差異而使組分得以分離。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，大多數(shù)用于非離子型化合物。吸附色譜固定相可以分為極性和非極性兩大類。對(duì)流動(dòng)相的要求為：
1) 選用的溶劑應(yīng)當(dāng)與固定相互不相溶，并能保持色譜柱的穩(wěn)定性。
2) 選用的溶劑應(yīng)有高純度，以防所含微量雜質(zhì)在柱中積累，引起柱性能的改變。
3) 選用的溶劑性能應(yīng)與所使用的檢測(cè)器相匹配，如果使用紫外吸收檢測(cè)器，就不能選用在檢測(cè)波長(zhǎng)下有紫外吸收的溶劑；若使用示差折光檢測(cè)器，就不能用梯度洗脫。
4) 選用的溶劑應(yīng)對(duì)樣品有足夠的溶解能力，以提高測(cè)定的靈敏度。
5) 選用的溶劑應(yīng)具有低的黏度和適當(dāng)?shù)偷姆悬c(diǎn)。
6) 應(yīng)盡量避免使用具有顯著毒性的溶劑，以保證工作人員的安全。
液固色譜法是以表面吸附性能力為依據(jù)的，所以它常用于分離極性不同的化合物，也能分離那些具有相同極性基團(tuán)，但數(shù)量不同的樣品。
2. 液液分配色譜法
固定相為液體，根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中的溶解度不同而分離。依固定相和流動(dòng)相的極性不同可分為正相色譜法和反相色譜法。正相色譜法采用極性固定相，流動(dòng)相為相對(duì)非極性的疏水性溶劑，常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物；反相色譜法一般用非極性固定相，流動(dòng)相為水或緩沖溶液，適用于分離非極性和極性較弱的化合物。其中，反相色譜應(yīng)用。
3. 離子交換色譜法
固定相是離子交換樹脂。樹脂上可電離離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的離子及被測(cè)組分的離子進(jìn)行交換，根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷吸引力而分離。
4. 分子排阻色譜法
分子排阻色譜法又稱凝膠色譜法，它是按照分子尺寸大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法。分子排阻色譜法的固定相凝膠是一種多孔性的聚合材料，有一定的形狀和穩(wěn)定性，利用分子篩對(duì)分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。根據(jù)所用流動(dòng)相的不同，凝膠色譜法可以分為兩類：即用水溶劑做流動(dòng)相的凝膠過濾色譜法(GFC)與用有機(jī)溶劑如做流動(dòng)相的凝膠滲透色譜法(GPC)。
二、應(yīng)用
高效液相色譜法只要求樣品能制成溶液，不受樣品揮發(fā)性的限制，流動(dòng)相可選擇的范圍寬，固定相的種類繁多，因而可以分離熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質(zhì)。
與試樣預(yù)處理技術(shù)相配合，HPLC 所達(dá)到的高分辨率和高靈敏度，使分離和同時(shí)測(cè)定性質(zhì)上十分相近的物質(zhì)成為可能，能夠分離復(fù)雜相體中的微量成分。隨著固定相的發(fā)展，有可能在充分保持生化物質(zhì)活性的條件下完成其分離。
HPLC成為解決生化分析問題前途的方法。由于HPLC具有高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反復(fù)利用，流出組分易收集等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用到生物化學(xué)、食品分析、醫(yī)藥研究、環(huán)境分析、無(wú)機(jī)分析等各種領(lǐng)域。高效液相色譜儀與結(jié)構(gòu)儀器的聯(lián)用是一個(gè)重要的發(fā)展方向。
液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)受到普遍重視，如分析氨基甲酸酯農(nóng)藥和多核芳烴等； 液相色譜- 紅外光譜聯(lián)用也發(fā)展很快，如在環(huán)境污染分析測(cè)定水中的烴類，海水中的不揮發(fā)烴類，使環(huán)境污染分析得到新的發(fā)展。
百歐博偉生物（biobw）是北京的一家專業(yè)于生物技術(shù)的研究與廣泛運(yùn)用及推廣的高科技公司，位于北京企業(yè)林立的豐臺(tái)區(qū)造甲街，生物技術(shù)推廣及運(yùn)用早于2011年開始，成立公司于2013年一月。本公司主要提供色譜耗材、色譜儀器、固相萃取裝置、化學(xué)試劑、樣品瓶、氘燈、標(biāo)準(zhǔn)品、微生物技術(shù)、菌種保藏服務(wù)以及ATCC產(chǎn)品代理等產(chǎn)品及服務(wù)。
