據(jù)今年3月份發(fā)布在ResearchSquare的一項(xiàng)研究，佛羅里達(dá)的科學(xué)家使用CUT&RUN技術(shù)，建立了眼球晶狀體中HIF1α結(jié)合位點(diǎn)的全基因組圖。
我們知道，基因表達(dá)可以通過(guò)許多不同的機(jī)制進(jìn)行調(diào)節(jié)，包括轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白和其他DNA結(jié)合蛋白。繪制出DNA和蛋白質(zhì)之間的相互作用圖譜，對(duì)于理解基因激活或抑制以及其他細(xì)胞過(guò)程至關(guān)重要。
傳統(tǒng)上，可以通過(guò)進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀和測(cè)序(ChIP-seq)來(lái)分析這些相互作用。但是這種方法需要大量的起始材料才能產(chǎn)生足夠強(qiáng)的信號(hào)以消除背景噪聲，并且經(jīng)常返回假陽(yáng)性信號(hào)。同時(shí)，ChIP-seq還需要優(yōu)化的超聲處理來(lái)破碎染色質(zhì)，這可能非常耗時(shí)并可能導(dǎo)致樣品損失。
在zui近的一項(xiàng)研究中，佛羅里達(dá)大西洋大學(xué)和國(guó)家糖尿病、消化和腎臟疾病研究所的科學(xué)家們利用CUT&RUN技術(shù)建立了一個(gè)功能性全基因組圖譜，該圖譜是一種稱(chēng)為缺氧誘導(dǎo)因子的蛋白質(zhì)復(fù)合物的特異性結(jié)合位點(diǎn)—HIF1α，位于人眼的晶狀體中。該團(tuán)隊(duì)表示選擇CUT&RUN而不是ChIP-seq分析，是因?yàn)榍罢卟恍枰?span style="font-family: Calibri;">DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)。此外，與ChIP-seq相比，前者成功實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞計(jì)數(shù)J低。
正常而言，隨著出生后眼睛的發(fā)育，提供健康血液供應(yīng)的血管隨著時(shí)間的推移開(kāi)始萎丨縮。結(jié)果，眼睛中的氧氣含量穩(wěn)步下降，造成缺氧環(huán)境。HIF1α作為一種蛋白質(zhì)復(fù)合物，可調(diào)節(jié)身體對(duì)缺氧環(huán)境的反應(yīng)，這意味著它可以在晶狀體細(xì)胞發(fā)育和體內(nèi)平衡中發(fā)揮作用。
研究人員首先選擇培養(yǎng)10天左右的大的WhiteLeghorn雞胚胎中分離出晶狀體細(xì)胞。收獲的細(xì)胞用稱(chēng)為DMOG的HIF1α激活劑處理4小時(shí)，并用ConA包被的磁珠固定細(xì)胞核。之后，樣品被分為兩組：一組用HIF1α抗體處理，另一組用IgG抗體處理。將pA/MNase添加到樣品中以啟動(dòng)碎裂。這種融合蛋白在與感興趣的蛋白質(zhì)相互作用的特定區(qū)域剪切DNA——在這種情況下，該蛋白質(zhì)是HIF1α。通過(guò)向樣品中加入CaCL2溶液來(lái)激活MNase，將DNA片段釋放到上清液中。CUT&RUN片段用蛋白酶K處理1小時(shí)，然后分離DNA進(jìn)行測(cè)序。
在HIF1α激活后，CUT&RUN在原代晶狀體細(xì)胞中鑒定了8000多種HIF1α-DNA特異性復(fù)合物。他們能夠使用ATAC-seq和RNA-seq驗(yàn)證并完成結(jié)合位點(diǎn)的映射，這表明這些復(fù)合物中約有1200個(gè)緊密聚集在染色質(zhì)可及區(qū)域。進(jìn)一步的分析揭示了526個(gè)基因的激活或抑制，其中116個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)10kB內(nèi)顯示HIF1α結(jié)合位點(diǎn)。
該實(shí)驗(yàn)中收集的數(shù)據(jù)有助于建立眼晶狀體中HIF1αDNA復(fù)合物的個(gè)功能圖，同時(shí)也強(qiáng)調(diào)了健康晶狀體發(fā)育對(duì)HIF1α的需求。zui終，CUT&RUN技術(shù)的這種成功應(yīng)用，有助于接下來(lái)的大量研究，重點(diǎn)是了解某些蛋白質(zhì)可能對(duì)基因表達(dá)的作用。
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結(jié)果展示：
