無機(jī)離子在自然界中起著許多生理作用。陽離子和陰離子參與神經(jīng)傳遞、肌肉收縮、細(xì)胞內(nèi)水分運(yùn)輸、血液中的酸堿平衡、骨形成、能量傳遞和儲存。此外，它們作為輔助因子發(fā)揮作用，或者可以作為其它重要生物分子中的部分被發(fā)現(xiàn)。
艾美捷 BioVision 一氧化氮熒光檢測試劑盒可提供準(zhǔn)確、可靠的檢測結(jié)果在一個簡單的兩步過程中方便地測量總硝酸鹽/亞硝酸鹽濃度。
硝酸鹽+亞硝酸鹽的測量：
1.標(biāo)準(zhǔn)品制備：添加5µl重組10 mM硝酸鹽/亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品在995µl分析緩沖液中，旋渦產(chǎn)生50µM工作標(biāo)準(zhǔn)溶液。加0,4,，將8、12、16、20µl工作標(biāo)準(zhǔn)加入6個連續(xù)井中，生成0、200、400，6008001000pmol/井標(biāo)準(zhǔn)。使用分析緩沖液使體積達(dá)到75µl。
注意：DAN探針與亞硝酸鹽而非硝酸鹽反應(yīng)。對于常規(guī)總亞硝酸鹽/硝酸鹽測定，只能制備硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線。但是，如果需要測量亞硝酸鹽和硝酸鹽濃度單獨(dú)使用時，可在標(biāo)準(zhǔn)曲線和分析樣品中沒有硝酸還原酶。硝酸鹽=總量-亞硝酸鹽。
2.制備樣品：可能需要過濾含有高蛋白濃度的樣品在分析前通過10 kDa MW截止過濾器（BioVision Cat#1997-25）。添加0-75µl的向孔中取樣，并使用分析緩沖液將體積調(diào)節(jié)至75µl。
注：典型的尿液亞硝酸鹽和硝酸鹽水平在0.2-2mm和1-20µM范圍內(nèi)分別地典型正常血清水平分別為0-20µM和0-2µM各種疾病狀態(tài)顯著提高了這些水平。血漿樣本或組織應(yīng)使用不超過10µl的未稀釋樣品對勻漿進(jìn)行分析。酚紅細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清可能會降低讀數(shù)，從而形成標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)使用相同的媒體制作。
3.向所有孔中添加5µl酶輔因子工作溶液。
4.向硝酸鹽分析孔（未知和標(biāo)準(zhǔn)）中添加5µl硝酸還原酶，添加5測定時，用µl緩沖液代替硝酸還原酶（未知值和標(biāo)準(zhǔn)值）亞硝酸鹽分開。
5.用蓋子蓋上平板，并在室溫（RT）下培養(yǎng)1-4小時。1小時硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽的轉(zhuǎn)化率約為90%，2小時轉(zhuǎn)化率約為95%，4小時轉(zhuǎn)化率約為99%轉(zhuǎn)變
6.向每個孔中添加5µl增強(qiáng)劑。孵育30分鐘以淬滅干擾化合物。
7.向每個孔中添加5µl DAN試劑。在室溫下培養(yǎng)10分鐘。
8.向每個孔中添加5µl NaOH。在室溫下培養(yǎng)10分鐘。
9在熒光計中使用Ex=360 nm和Em=450 nm讀取板。
