支原體污染會影響ATCC細胞的形態(tài)、功能、代謝、細胞膜、生長速率、誘導染色體畸變、細胞內(nèi)信號傳導等各種細胞特性。受支原體污染的細胞在培養(yǎng)時培養(yǎng)基的pH值不會發(fā)生改變, 也不會渾濁,因此, 很難直接觀察出細胞是否受到污染。常用的支原體檢測方法有培養(yǎng)法、DNA熒光染色法、酶聯(lián)免疫吸附法和PCR法等。

1. 培養(yǎng)法

培養(yǎng)法是Z傳統(tǒng)的檢測方法, 該方法能直觀地顯示是否存在支原體污染。將細胞培養(yǎng)物置于PPLO肉 湯 培 養(yǎng) 基(pleuropneumo-nia-like organismsbroth base)中, 37 °C培養(yǎng)3天后離心, 將沉淀物轉移至PPLO瓊脂培養(yǎng)基相同條件下培養(yǎng)4~6周, 觀察是否有“煎雞蛋”樣菌落出現(xiàn), 若有即為支原體污染。

這種方法簡單易行, 但耗時比較長, 且存在不少缺陷。支原體由于遺傳缺陷, 導致某些代謝途徑缺失, 其生長很大程度依賴于培養(yǎng)基的成分。在
配制培養(yǎng)基時, 任何成分質(zhì)量或批次的不同都會影響支原體的生長, 從而影響檢測的靈敏度。不同的生長條件(如好氧、厭氧、微氧等)也會影響檢測結果, 易導致假陽性。此外, 還有許多支原體無法培養(yǎng), 因此, 使用培養(yǎng)法的檢測結果并不全面。

2. DNA熒光染色法

DNA熒光染色法是基于使用熒光染料DAPI或Hoechst 33258的細胞化學染色法。熒光染料能選擇性的結合ATCC細胞和支原體DNA的小溝, 因此, 在準備過程中, 任何存在的DNA均會被染色且DNADAPI復合物吸收波長為340~488nm。將待測細胞單層培養(yǎng)至70%~90%匯合度時,  以5×104/mL~1×105/mL濃度轉接至蓋玻片上培養(yǎng)12~24小時, 用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌, 并在37 °C下用DAPI-甲醇溶液染色15分鐘, 無菌水洗滌
并烘干后置于檸檬酸緩沖液(pH5.5)?甘油(2?1)條件中, 用指甲油密封。處理后的玻片置于熒光顯微鏡下觀察, 被支原體污染的細胞經(jīng)染色后, 細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一的熒光點。

3. ELISA法

酶促反應作為生物化學檢測手段可應用于培養(yǎng)細胞中支原體的檢測, 如通過測乙酸激酶、氨基甲酸激酶等各類酶的活性, 能快速、靈敏地對
細胞培養(yǎng)物進行篩選檢測。酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbnentassay, ELISA)試劑可通過商業(yè)渠道購買, 其中包括針對細胞培養(yǎng)過程中常見支原體/膽甾原體抗原的多克隆抗體。用于檢測的抗體與生物素共軛結合后, 鏈霉親和堿性磷酸酶水解4-硝基苯基磷酸生成黃色的硝基苯酚產(chǎn)物, 在405 nm波長下通過酶標儀量化。ELISA檢測支原體污染有較好的特異性和敏感性, Z顯著的優(yōu)點是能一次檢測大量樣品。

4. 基于DNA聚合酶鏈式反應(PCR)的擴增檢測

PCR技術是根據(jù)DNA高溫變性、低溫退火、適溫延伸的原理進行的擴增技術。自Uemori等公布了12種支原體16S-23S rRNA區(qū)域的序列后, 應用PCR技術進行支原體檢測的研究迅速發(fā)展。16S、16S-23S、23S rRNA是支原體基因組內(nèi)的保守區(qū)域, 根據(jù)這些區(qū)域的序列設計特異性引物, 使用PCR的方法擴增后, 利用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測, 通過比對分析擴增產(chǎn)物的大小, 可進行支原體感染的初步分析鑒定。PCR檢測法與傳統(tǒng)培養(yǎng)或熒光染色技術相比,
ATCC細胞具有快速、穩(wěn)定、易重復及靈敏度高等特點。但易受其他污染物如細菌、真菌影響導致假陽性結果, 且仍處于實驗室研究階段, 尚無標準、準確的一套檢測方案。